本发明涉及一种用于预防禽安卡拉病的重组蛋白及构建方法和应用，属于基因工程生物医药技术领域。分别构建并化学合成4型禽腺病毒四种结构蛋白的多抗原表位串联蛋白的编码DNA，再将这四种多抗原表位串联蛋白的编码DNA连接，获得编码多联融合重组蛋白的基因，构建用于大肠杆菌原核表达系统的重组表达质粒，并转入大肠杆菌感受态细胞，获得大肠杆菌基因工程表达菌，并诱导表达和大量纯化多联融合重组蛋白，将多联融合重组蛋白与免疫佐剂混合制备禽安卡拉病多表位亚单位疫苗。本发明亚单位疫苗具有强免疫原性，能够刺激机体产生保护性抗体，且抗体维持时间长，可以有效预防禽4型腺病毒感染发病，对禽安卡拉病具有预防保护作用。