本发明公开了基于血清样本的胆汁酸全通路代谢轮廓的检测方法，包括：制备样本；使用超高效液相色谱串联飞行时间质谱推测鉴定血清样本中的胆汁酸，有标准品的，通过标准品的保留时间，一级质谱准分子离子和特征二级碎片离子的精确质荷比进行确认；没有标准品的，依据同类别胆汁酸的裂解规律及色谱特点，结合血清中一级和二级质谱数据及色谱行为进行鉴定；采用超高效液相色谱串联三重四极杆质谱定量分析胆汁酸、胆固醇和羟基固醇，有标准品的，通过标准品优化合适的检测条件，无标准品的，以超高效液相色谱串联飞行时间质谱定性一级和二级质谱数据为基础，优选特征子离子，优化锥孔电压和碰撞能量，实现定量分析；得到胆汁酸全通路代谢轮廓。