本发明提供一种基于硬件在环的定速巡航测试系统及方法，该系统包括：上位机、运行仿真模块，ECU控制器、第一I/O板卡、第二I/O板卡和CAN板卡。运行仿真模块通过第一I/O板卡与ECU控制器信号连接，ECU控制器还与其连接的油门踏板、制动踏板、模拟车速电机和电子节气门信号连接。电子节气门通过第二I/O板卡与运行仿真模块信号连接，CAN板卡分别与模拟车速电机、运行仿真模块和ECU控制器通过CAN总线连接。运行仿真模块用于模拟定速巡航的运行环境，并通过第一I/O板卡和第二I/O板卡输入输出仿真信号。上位机与运行仿真模块信号连接，用于运行人机交互界面并输出运行指令，以使操作人员通过上位机实现人机交互。本发明能降低汽车测试成本，提高测试效率和安全性。