本发明涉及肝素分离纯化技术领域，具体涉及一种扩张床逆流色谱分离纯化肝素的方法；以阴离子交换树脂作为固体吸附介质，将其加入扩张床逆流色谱分离柱中，肝素溶液上样至扩张床逆流色谱进行吸附、洗脱、醇沉、离心、洗涤得纯化后的肝素。本发明将固定床柱层析中普遍使用的固体分离介质加入逆流色谱的分离柱中，基于逆流色谱流体动力学平衡原理，在分离柱中形成吸附介质扩张分散的状态，构建出扩张床逆流色谱，可作为一种新型的色谱分离方法用于分离极性多糖类肝素药物。该方法处理样品量高、吸附介质利用率显著提升，在极性多糖类生物活性大分子的分离纯化中具有良好的应用前景。