本发明公开了Keratin 5‑IRES‑eGFP敲入的hESCs细胞系的构建及诱导分化方法。具体方法为：构建sgRNA质粒，根据sgRNA切割位点构建打靶Doner载体，将cas9质粒，sgRNA质粒，打靶Doner载体共电转至hESCs细胞，得到初步阳性单克隆细胞系后电转表达cre酶的质粒，通过PCR跑胶和测序得到最终Keratin 5‑IRES‑eGFP敲入的hESCs细胞系。诱导分化hESCs细胞为角质形成细胞从而得到Keratin 5阳性的基底层角质形成细胞。该细胞系的建立有利于筛选出Keratin 5阳性的基底层角质形成细胞，从而为临床上表皮基底角质形成细胞异常的皮肤病研究提供细胞模型。