本发明公开了一种罗非鱼副产物抗菌肽及其筛选方法和应用，属于抗菌肽制备领域。本发明通过将罗非鱼副产物进行酶解得到粗抗菌肽；再将制得的粗抗菌肽进行分离纯化，并对纯化后的组分进行抑菌实验；最后选择抑菌效果最佳的肽组分进行质谱分析，通过MASCOT检索数据库搜索质谱图，得到了13条具有高抗菌活性的罗非鱼副产物抗菌肽。本发明采用的原料罗非鱼资源丰富、易于获得、蛋白质等营养物质含量高，且减少了资源浪费与环境污染，得到的抗菌肽具有广谱抗菌活性，为开发利用罗非鱼副产物以制备抗菌药物提供了理论支持和技术参考。