本发明公开了一种利用第三代碱基编辑器制备精准BLG基因敲除牛的方法。本发明保护基因敲除奶牛的制备方法，包括如下步骤：将出发奶牛基因组中BLG基因自5’端第277位碱基由C突变为T；所述BLG基因为SEQ ID No.1所示的DNA分子。本发明建立了一种大动物点突变技术，可以进行精确的单碱基突变，通过巧妙设计C‑T的突变，造成终止密码子从而进行蛋白翻译提前终止达到基因敲除的目的。该方法模拟自然突变动物，同时与传统基因编辑技术相比，基于BE3的点突变技术并不产生基因组双链断裂,因而极大地避免了随机突变乃至基因组损害，因此更具有安全性。本发明为牛的精确基因编辑及基因敲除研究提供重要技术支持。