本发明公开了制备用于测序的核酸的方法及其应用，其中，制备用于测序的核酸的方法包括：提供第一序列，所述第一序列包含靶序列和第一重组酶识别序列；提供第二序列，所述第二序列包括：中间段：所述中间段形成至少一个双链体区域，且含有第二重酶识别序列，且所述第一重组酶识别序列与所述第二重酶识别序列具有至少一个相同的酶切序列；两个接头段：所述两个接头段分别位于所述中间段的端部，且每个所述接头段含有至少一个单链体区域，且其中一个接头段含有至少一个引物结合位点；以及将所述第一序列和所述第二序列接触，进行重组反应，以便获得所述用于测序的核酸，所述用于测序的核酸含有所述靶序列。