本发明公开了构建DNA文库的方法及其应用。其中，该方法包括将DNA样本进行末端修复后，利用耐高温聚合酶对DNA样本进行加腺苷酸尾处理，以便得到加尾后的DNA，其中，所述末端修复和所述加腺苷酸尾处理是连续进行的；以及将所述加尾后的DNA进行接头连接处理，以便得到连接产物，DNA文库其中，所述末端修复和加腺苷酸尾处理的条件是：27‑37摄氏度，5‑30分钟；70‑75摄氏度，10‑20分钟。该方法末端修复和加腺苷酸尾处理连续进行，中间无需纯化处理，稳定性好，同时还显著缩短了反应时间和反应流程。