本发明涉及一种检测抗体结合能力的方法及其应用，所述方法包括：待测抗体与固相载体孵育，所述固相载体混合包被有表达靶抗原的细胞和表达荧光蛋白的细胞；抗待测抗体的二抗与固相载体孵育，所述二抗标记有荧光染料；检测所述二抗的荧光信号和所述荧光蛋白的荧光信号，根据所述荧光蛋白的荧光信号将所述二抗的荧光信号分成抗体‑靶抗原特异性结合信号和抗体‑非靶抗原非特异性结合信号；根据所述抗体‑靶抗原特异性结合信号获取所述抗体的特异性结合力，根据所述抗体‑非靶抗原非特异性结合信号获取所述抗体的非特异性结合力。本发明所述方法能够简便、高效地筛选获得亲和力高、特异性好的抗体，降低假阳性。