本发明公开了一种基于丝素蛋白和甲壳素混纺纳米纤维嵌入式水凝胶软骨仿生支架的制备方法及应用。本发明利用桑蚕丝制备再生丝素蛋白，提纯工业级甲壳素，将丝素蛋白溶液和甲壳素溶液混合并通过静电纺丝技术制备混纺纳米纤维膜，经乙醇梯度交联后，由混纺纳米纤维制得短纤维，混合短纤维和丝素蛋白溶液后，经交联剂交联后冷冻成型，得到海绵状软骨仿生支架。尤其是纳米短纤维的嵌入提高了支架材料的压缩强度和生物相容性。本发明构筑了一种生物相容性好，免疫排斥反应低，组成成分与天然软骨基质相似的仿生支架；且材料来源广泛，成本低，制备工艺简单，可用于构建组织工程软骨，修复软骨退变，具有良好的临床应用前景。