本发明公开一种确定探针集的方法，所述探针集包含多个探针，所述方法包括：获取DNA序列集，所述DNA序列集包含多条长度为K0的DNA序列，获取所述DNA序列集包括，从长度为L的参考序列的一端的第i个核苷酸开始，沿另一端方向拷贝所述参考序列的K0个连续核苷酸为一条DNA序列，i依次取{1，2，…，(L‑K0)，(L‑K0+1)}中的数值；筛选所述DNA序列集，以获得所述探针，其中包括，过滤掉与所述参考序列的匹配位置个数大于2的DNA序列；其中，200nt≥K0≥50nt。本发明还公开一种试剂盒、该试剂盒的用途以及一种确定物种丰度的方法。