本发明公开了一种纯化氧化型β‑烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，包括步骤：将酶催化反应所得反应液用滤膜进行微滤和纳滤，收集浓缩液备用；然后将浓缩后的滤液加入酸调节浓缩液pH，用反相色谱柱为固定相，以缓冲盐溶液为A相、乙醇为B相，进行梯度洗脱纯化；将纯化所得的溶液用滤膜纳滤浓缩，然后用真空冷冻干燥机冻干。本发明使用反相高效液相色谱纯化氧化型β‑烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，使得氧化型β‑烟酰胺腺嘌呤二核苷酸纯度高、收益好，达到产业化要求。