本发明公开一种用于检测石斑鱼虹彩病毒感染的DNA核酸适配体及其筛选方法和应用。在每轮筛选过程中，引入两次反筛的步骤，首先将前一轮的单链DNA文库与正常细胞结合，以去除与正常石斑鱼细胞结合的非特异ssDNA，然后将上清与被石斑鱼虹彩病毒感染的细胞进行结合筛选，从被石斑鱼虹彩病毒感染的细胞上分离得到的ssDNA，然后再和正常细胞结合，分离得到上清。PCR扩增文库制备出单链的DNA文库。重复以上的筛选流程，与第一轮筛选的正常细胞数目相比，将筛选过程中正常细胞的数目提高2‑6倍，与第一轮筛选的文库与细胞的结合时间相比，在随后的筛选过程中，文库与正常细胞结合时间从0.5h增加至1h，文库与病毒感染细胞结合时间从1h缩短至0.5h，以提高每轮的筛选效率。