本发明涉及BHK-21细胞全悬浮培养技术在新城疫疫苗生产中的应用。本发明公开的BHK-21细胞全悬浮培养生产新城疫疫苗的工艺包括以下步骤：(1)病毒株选育：鸡胚培养的新城疫疫苗种毒接种单层BHK-21细胞，加入病毒维持液培养，得到适应BHK-21细胞的新城疫疫苗毒，并进行系统鉴定；(2)悬浮细胞株的驯化与选育：适合新城疫病毒培养用全悬浮BHK21细胞的驯化和基础种子的建立；(3)悬浮细胞扩大培养；(4)接毒和收毒：适应BHK-21细胞的新城疫疫苗毒接种及其毒液收获；(5)增殖新城疫疫苗毒的毒价测定与配苗。本发明使得新城疫疫苗实现了由鸡胚向哺乳动物细胞大规模培养生产的转变，这不仅简化了新城疫疫苗的生产工艺，降低生产成本，还大大提高疫苗的产量和质量。