本发明涉及哺乳动物细胞高效表达载体pSNEO，该载体是基于新霉素抗性筛选基因NEO通过联合弱化筛选基因表达和增强目的基因表达的策略构建而成。其中，筛选基因的弱化包括两方面，在启动子中引入缺失突变实现筛选基因的转录弱化，然后在筛选基因翻译起始位点前引入发夹结构序列以实现筛选基因的翻译弱化。目的基因的表达增强是在目的基因表达框的多克隆位点与PolyA加尾信号之间加入转录调控元件WPRE序列。本发明构建的pSNEO载体可以方便快速的完成目的基因的稳定高表达细胞株的构建，为大分子重组蛋白的制备提供了新的工具。