本发明公开了一种检测四环素的单链抗体及其编码基因与应用。本发明提供的单链抗体，是由重链可变区、连接肽和轻链可变区组成的多肽；所述连接肽位于所述重链可变区与所述轻链可变区之间；所述重链可变区如序列表的序列１自Ｎ末端第1至118位氨基酸残基所示；所述轻链可变区如序列表的序列１自Ｎ末端第134至244位氨基酸残基所示。本发明克服了以往单克隆抗体制备的整个生产过程复杂，消耗时间长，费用高，且不易进行操作的不足，提供一种新的基因工程单链抗体，应用该抗体，研制检测四环素的胶体金免疫试纸条，确定胶体金免疫试纸条试剂配方及生产工艺，用于检测四环素残留，具有简便、快速、廉价的特点，其应用具有广阔前景。