本发明涉及DNA-PKcs在制备影响DHFR基因扩增改变肿瘤细胞对MTX耐药性的药物中的应用，属于生物医药。本发明通过建立MTX耐药细胞进化模型，选取低浓度耐药（HSRs）和高浓度耐药（DMs）细胞为研究对象,检测亲本细胞及耐药细胞中的基因扩增程度和形式、DNA损伤情况及DNA-PKcs的表达情况，进而针对NHEJ途径的核心蛋白DNA-PKcs，在MTX耐药细胞中建立稳定干扰DNA-PKcs的克隆，检测稳定干扰克隆之中DHFR基因的扩增程度和扩增形式、细胞的生长、凋亡和耐药性的变化。