本发明公开了一种检测磺胺二甲基嘧啶和/或恩诺沙星的酶联免疫试剂盒及其应用。本发明所提供试剂盒包括抗体1、抗体2、包被原1、包被原2、酶标记物1和酶标记物2；所述抗体1为抗磺胺二甲基嘧啶的抗体，所述抗体2为抗恩诺沙星的抗体，所述包被原1为磺胺二甲基嘧啶半抗原与载体蛋白的偶联物，所述包被原2为恩诺沙星半抗原与载体蛋白的偶联物，所述酶标记物1为抗所述抗体1的酶标二抗，所述酶标记物2为抗所述抗体2的酶标二抗。本发明所提供试剂盒可定性或定量检测待测样品中磺胺二甲基嘧啶和恩诺沙星残留，样品前处理过程简单；本发明检验方法简便易行，特异性高、灵敏度高、精确度高。