本发明公开了一种表达禽网状内皮组织增生病病毒gp90基因的DNA疫苗及其构建方法和应用。本发明将REV gp90基因根据鸡偏嗜密码子进行密码子优化，基因两端设计两个酶切位点，克隆入pUC19载体中，得到pUC19-optigp90重组质粒，将其进行双酶切，将获得的optigp90基因亚克隆至pCAGGS表达载体中，构建了pCAGoptigp90重组表达质粒，将该重组质粒免疫SPF鸡，实验结果表明：该DNA疫苗可以诱导SPF鸡产生REV抗体，抗体阳转率为83%，免疫保护率为75%。本发明DNA疫苗既有亚单位疫苗和灭活疫苗的安全性，又具有弱毒疫苗或重组疫苗同时诱导体液免疫和细胞免疫应答的特点。