一种利用生物发酵和固定化酶法制备蔗糖-6-乙酯的方法，工艺步骤为：对巨大芽胞杆菌的发酵培养基加以改进；对枯草杆菌进行诱导培养，提取特异性果糖基转移酶并制成固定化果糖基转移酶；将炭黑曲霉制成固定化增殖细胞；固定化增殖细胞和固定化果糖基转移酶一起以葡萄糖-6-乙酯和蔗糖为底物，将葡萄糖-6-乙酯转化为蔗糖-6-乙酯；最后用色谱分离树脂柱纯化蔗糖-6-乙酯。用本发明方法生产葡萄糖-6-乙酯，产量从15g/L发酵液提高到55g/L，提供了可以重复使用的固定化酶，蔗糖-6-乙酯的产率能够提升到80％左右，并以色谱分离树脂柱代替制备型高效液相色谱法来纯化蔗糖-6-乙酯，大幅降低了成本。