本发明涉及到一种生物样品中多残留磺胺类抗生素的高效分离纯化方法，其特征在于包括以下步骤：(1)制备分子印迹聚合物：按模板分子：功能单体：交联剂的摩尔比1∶2～8∶25的比例配料，通过本体聚合法获得对磺胺类抗生素具有特异识别功能的分子印迹聚合物；(2)称取一定量待分离生物样品于研钵中，用研钵磨碎，加入适量上述分子印迹聚合物，进一步匀浆后得到匀浆样品；其中待分离生物样品与分子印迹聚合物的重量比为2∶1-5。(3)将所述的匀浆样品置于固相萃取小柱中，依次用2.0-4.0mL水、2.0-4.0mL 10wt％乙腈水溶液淋洗，然后用3.0-5.0mL甲醇/甲酸混合溶液洗脱；磺胺类抗生素即溶于甲醇/甲酸洗脱液中从所述的待分离生物样品中分离出来。本发明所提供的方法选择性广、分离纯化效果好。