本发明公开了一种敲除光滑球拟酵母线粒体基因的方法，属于基因工程技术领域。本发明主要采用长末端引物得到含有乙酰鸟氨化酸氨基转移酶基因(ARG8m)及待敲除线粒体基因的侧翼序列的同源重组片段，基因枪转化酵母线粒体，厌氧培养消除线粒体异质性得到只含有改造后的线粒体的上的转化子。本发明所得酵母菌，易于识别和保护；敲除方法为双倍体或多倍体酵母的基因工程改造提供了一种新的途径和方法；敲除方法简单、高效，保持酵母的原有特性不变，可以在5-7天内实现上的线粒体基因的敲除。