本发明一种重组人胰岛素的制备方法涉及蛋白质多肽类药物领域。本发明所要解决的技术问题是提供一种大肠杆菌表达重组人胰岛素的制备方法以克服现有技术中存在的使用有毒有害物质CNBr、生产工艺复杂之技术缺陷。本发明的重组人胰岛素的制备方法包括菌体破碎、包涵体溶解、胰岛素原磺化、纯化胰岛素原、胰岛素原复性和酶切转化等步骤，特征在于在包涵体溶解的过程中将胰岛素原的-SH转化为-SSO3-，经过阳离子纯化该磺化的胰岛素原、还原复性、酶切转化再经过阴离子交换层析纯化获得人胰岛素。本发明的重组人胰岛素的制备方法不使用CNBr，工艺简单、人胰岛素的收率和纯度高。