本发明涉及一种仿生牛黄的制备方法、仿生牛黄及其应用，属于中医药原料制备技术领域。所述制备方法以天然牛胆汁为发酵底物，利用发酵和/或酶促反应体系制备得到仿生牛黄，其中，所述发酵和/或酶促反应体系选自合成酶质粒、合成酶高表达工程菌和牛黄形成菌中的至少一种作为发酵菌种直接体外发酵；所述牛黄形成菌的菌种、合成酶高表达工程菌的载体及合成酶质粒的具体种类如文中所述。该法制备的仿生牛黄与天然牛黄成分的高度一致，其中胆酸（CA）含量为8.5%‑20.0%，去氧胆酸（DCA）含量为2.0%‑6.5%，指纹图谱相似度≥88.0%，药理实验表明本发明方法制备的仿生牛黄与天然牛黄作用效果相同，优于各对比例。