本发明提供了一种猪流行性腹泻病毒S蛋白突变体、核酸分子、亚单位疫苗及应用；所述猪流行性腹泻病毒S蛋白突变体相较于野生型猪流行性腹泻病毒S蛋白，将第1076位氨基酸、第1077位氨基酸、第1016位氨基酸、第1017位氨基酸均突变为脯氨酸。本发明构建了稳定且维持S蛋白在融合前构象的天然三聚体，获得了安全高效的PEDV亚单位疫苗，能够提升猪流行腹泻疫苗的使用效果和免疫原性；并且，相较于野生型S蛋白，本发明中的猪流行性腹泻病毒S蛋白突变体具有更高的表达量。