本发明属于生物技术领域，具体涉及一种3D蛋白突变的O型口蹄疫重组病毒株及其构建与应用。本发明将O型口蹄疫病毒3D蛋白的第403位甲硫氨酸突变为丙氨酸，并利用反向遗传技术成功构建并拯救获得了一种O型口蹄疫病毒3D蛋白突变的重组病毒株rFMDV‑M403A，所述重组病毒株在传代过程中氨基酸能稳定突变，且突变毒株生长速度较野生毒株有所减慢，病毒滴度显著降低；在个体实验中，对乳鼠感染显示，突变毒株会使乳鼠存活率提高，在肝脏中病毒载量和组织病变显著降低。本发明提供了一种减毒的口蹄疫重组病毒株，为深入理解口蹄疫病毒致病机制和防控策略提供了重要意义，也为进一步研制口蹄疫基因工程疫苗提供了重要的理论依据。