本发明公开了一种用于包装复制缺陷型重组人4型腺病毒的单质粒载体及其应用，所述单质粒载体含有E1区和E3区完全缺失，E4区被修饰的人4型腺病毒基因组，其中，未经修饰的E4区包括CDS1、CDS2、CDS3、CDS4、CDS5、CDS6区，所述被修饰包括人4型腺病毒基因组E4区的CDS5区被人5型腺病毒的E4区的ORF6区所取代。所述载体可以快捷、高效地制备稳定表达外源基因的人4型腺病毒载体重组病毒，具有安全性、强免疫原性以及高生产效率。