本发明公开了一种牡丹籽粕多肽的发酵酶解制备方法和应用，涉及酶工程技术领域。牡丹籽粕多肽的发酵酶解制备方法包括以下述步骤：牡丹籽粕与水混合进行蒸馏除油后，得到牡丹籽粕渣和牡丹籽粕渣液；牡丹籽粕渣进行发酵，得到牡丹籽粕蛋白提取物；将牡丹籽粕蛋白提取物与蛋白酶混合进行两次酶解，高温灭酶后，得到牡丹籽粕多肽酶解液；牡丹籽粕多肽酶解液经膜分离系统过滤，得到滤液与活性炭混合进行吸附脱色处理，脱色后去除活性炭，将滤液干燥得到牡丹籽粕多肽。本发明在制备多肽过程中通过发酵提取蛋白和两次酶解制备多肽，并对两次酶解的蛋白酶种类进行筛选，提高了多肽的产率和含量，降低了多肽的分子量，使多肽的分子量分布更为均匀。