本发明涉及生物技术领域，具体公开了一种高效生产外源蛋白的哺乳动物细胞系及其构建方法、应用。具体的，哺乳动物细胞系的构建方法包括：构建用于敲除HEK293F细胞中H11位点附近预设长度基因的敲除质粒；构建含有外源蛋白基因的同源模板质粒；将所述敲除质粒、同源模板质粒共同转染HEK293F细胞，并培养；其中，所述同源模板质粒还含有依次连接的H11位点5’同源臂、CMV启动子和H11位点3’同源臂。本发明通过在哺乳动物HEK293F细胞基因组H11位点插入外源目的蛋白基因，构建了稳定表达细胞株，从而实现高效生产目的蛋白，为蛋白产品表达和生产提供新方法。