本发明涉及生物技术领域，特别涉及D‑氨基酸氧化酶突变体及其在动力学拆分DL‑草铵膦和多酶催化制备L‑草铵膦中的应用。本发明通过蛋白截短、多位点组合突变、添加融合标签等方法，使宿主表达获得的D‑氨基酸氧化酶可溶性表达及酶活有了显著提升。进一步对D‑氨基酸氧化酶的活性口袋进行改造，提供了多种能够高效催化D‑草铵膦合成2‑羰基‑4‑(羟基甲基膦酰基)丁酸(PPO)的氨基酸氧化酶突变体，使D‑氨基酸氧化酶的酶活进一步提升。利用本发明提供的D‑氨基酸氧化酶制备α‑酮酸的方法实现了外消旋草铵膦的动力学拆分，能够广泛应用到L‑草铵膦的生产应用中。