本发明公开了一种免灌注法分离心室肌细胞和心房肌细胞的方法，涉及心肌细胞分离技术领域，过程包括：离体心脏放到PBS中清洗，剪开心室和心房，放入含有10mM BDM的0.25％酶胰蛋白酶中，4℃消化12‑18h弃掉胰酶，用灌流液洗一次，而后消化酶37℃摇晃消化，8‑10min收集上清，放入中和液，重复3‑4次，直至组织块消失，过滤；滤液一次重力沉降，弃掉上清，复钙液重悬，二次重力沉降，弃掉上清，培养细胞。本发明的分离方法简便，能够完全分开心房肌细胞和心室肌细胞，得到适于培养的成年大鼠心肌细胞。杆状率69％‑79％；培养6天后，细胞仍然跳动，表达心肌细胞特异标志物α‑actinin。具有钙信号的波动，心房肌细胞纯度为52％，心室肌细胞纯度为88％。