本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种质粒提取试剂盒及提取方法。本发明的质粒提取试剂盒，包括菌体重悬液、菌体裂解液、质粒复性液、洗脱液、硅胶吸附柱。菌体裂解液由NaOH、SDS、亚硒酸钠和水组成，NaOH、SDS和亚硒酸钠的浓度为：NaOH0.3‑0.5mol/L、SDS1‑3%、亚硒酸钠0.1‑0.3mol/L；质粒复性液由别嘌醇、异硫氰酸胍和水组成，别嘌醇、异硫氰酸胍的浓度为：别嘌醇0.5‑2mol/L、异硫氰酸胍2.5‑4.5mol/L。与现有的技术相比，本发明的质粒提取试剂盒提高了质粒浓度与纯度，降低了内毒素的含量，能够满足后续分子生物学实验的进行。