本发明提供一种小分子化合物介导的牛性控精子分选液及其应用，包括精子分选保护液和性控功能成分，所述精子分选保护液为：氯化钠、氯化钾、二水氯化钙、磷酸二氢钠、葡萄糖、丙酮酸钠、碳酸氢钠、青链霉素、酚红；所述性控功能成分为：肌酸、24e药物；所述肌酸的浓度为450 uM‑550 uM；所述24e药物的浓度为0.27 uM‑0.33 uM；所述24e药物为吡啶[3，2‑d]嘧啶类TLR7&8双激动剂；本发明能够满足生产中对性控精液的大量需求，而且分选过程是在精子所适宜条件下进行的且不需要对精子进行复杂的处理，分选花费时间少，对精子产生伤害小。