本发明公开了一种多基因治疗的溶瘤腺病毒GOV31及其构建方法和应用，以溶瘤腺病毒SD55为载体，利用基因工程方法，构建携带PDL1‑shRNA序列与CXCL9、GM‑CSF序列的重组溶瘤腺病毒AD‑SD55‑shRNA‑CXCL9‑GMCSF，同时表达干扰PD‑L1的shRNA、趋化因子CXCL9、免疫因子GM‑CSF。本发明具有溶瘤广谱性且抗肿瘤效果好，为病毒疗法、基因治疗、免疫疗法相结合的癌症靶向治疗提供了新方向。