本发明提供了一种生物杀虫剂、制备方法及用途。本发明采用假单胞菌属微生物以葡萄糖和植物油脂为复合碳源进行发酵，发酵液经过浓缩、水解和液固分离得到富含中链羟基脂肪酸溶液。然后利用该溶液的广谱性杀虫作用，起到植物保护的作用。采用复合碳源(水溶性葡萄糖和脂溶性油脂)可缩短中链羟基脂肪酸的发酵时间和提高油脂利用率，而且简化分离步骤，高效降低了发酵和分离成本。施用羟基脂肪酸减少了菜青虫、水稻二化螟、飞虱、蓟马和豆荚冥，并增加了植物活力和产量。中链羟基脂肪酸的杀虫活性与化学处理相当，优于美国混合脂肪酸类生物农药M‑PEDE。用中链羟基脂肪酸喷施还可以起促吸收与提高作物产量的功效。