本发明属于抗体制备技术领域，尤其涉及抗人MSH6蛋白的兔单克隆抗体及其应用。所述抗人MSH6蛋白的兔单克隆抗体的轻链互补决定区1、轻链互补决定区2和轻链互补决定区3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3‑5所示；重链互补决定区1、重链互补决定区2和重链互补决定区3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8‑10所示。本发明的抗体可以特异性识别细胞和组织表达的人MSH6蛋白，与人MSH6蛋白结合的亲和力好，适用于MSH6蛋白的免疫检测领域，尤其是免疫组织化学检测，用于免疫检测时具有高准确性、高灵敏度、高特异性以及优良的抗干扰能力等优势。