本发明提供了一种微生物生根剂及其制备方法和应用，涉及生物肥料技术领域。本发明的微生物生根剂，组分包括由复合细菌经发酵后制备得到的复合细菌菌液；所述复合细菌包括组分：交替单胞菌、短小芽孢杆菌、科贝特氏菌、黄杆菌和短芽孢杆菌；微生物生根剂还包括组分：液体培养基和诱变剂；经过两次发酵培养后得到的复合发酵液富含寡糖、寡核苷酸、寡肽及小分子糖肽及生命因子的代谢生物。本发明的微生物生根剂应用于肥料的制备中，对农作物具有显著促进根系生长发育和植株的生长的效果。