本发明公开了一种三疣梭子蟹近交系建立方法及应用，属于三疣梭子蟹育种技术领域，所述方法为收集不同野生群体种质资源，采用单池单蟹模式构建全同胞家系，180日龄时通过生长速度、养殖成活率综合指数进行家系选择，家系内选择优良不带病毒的雌蟹转移至室内越冬，然后进行亲蟹强化培育，再次选择优质抱卵亲蟹，采用单池单蟹模式构建全同胞家系；全同胞兄妹连续自交，建立三疣梭子蟹近交系。本发明通过家系选育、营养强化等措施，克服三疣梭子蟹自交过程中繁殖力下降、性状分化等难点，首次建立三疣梭子蟹自交18代近交系，性状稳定，养殖成活率提高20％以上，整齐度高，全甲宽变异系数＜10％。并应用近交家系，完成了三疣梭子蟹高质量遗传连锁图谱构建和全基因组组装。