本发明公开烟草烟碱代谢相关转录因子NtbHLH66及其编码基因、RNAi干扰载体和应用。本发明的烟草烟碱代谢相关转录因子编码基因NtbHLH66基因，其核苷酸序列为：(1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；(2)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代和/或缺失和/或添加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白的核苷酸序列。通过对烟草NtbHLH66基因的表达进行干扰，发现将NtbHLH66基因沉默后，与对照株系相比，NtbHLH66基因干扰株系苗期叶片中烟碱含量明显降低。本发明为降低烟草中烟碱含量提供新的策略和路径，在低烟碱烟草品种育种领域具有广阔的应用前景和巨大的经济效益潜力。