本发明公开了一种将维生素D3转化成25‑羟基维生素D3的基因工程菌及其基因、表达载体与应用，基因工程菌包含至少一个编码25‑羟基氧化酶的外源DNA序列，其基因序列为SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。本发明中采用全细胞合成法来合成25‑羟基维生素D3；普通生物合成经常选用大肠杆菌作为宿主，由于其是革兰氏阴性菌，在发酵后期会产生内毒素，在食品工业和饲料业使用受到限制；而本发明使用枯草芽孢杆菌作为基因表达宿主，枯草芽孢杆菌有着长期制备发酵食品的历史，是一种被中国农业部和美国FDA公认的安全微生物，可以提供食品安全级的25‑羟基维生素D3的制备。