本发明提供了一种展示纳米抗体的酵母文库及其构建方法和应用，属于纳米抗体技术领域。本发明针对酵母菌展示纳米抗体系统中亚型免疫球蛋白的重链和轻链可变结构的N端与负责识别抗原的CDRs相近，导致纳米抗体结合域的N端融合可能会干扰抗原结合，进而影响纳米抗体的筛选的问题，本发明优化酵母菌展示纳米抗体系统，每个纳米抗体的C‑末端与Aga2p的N‑末端融合，避免了结合域的N端融合可能会干扰抗原结合；此外纳米抗体在单个酵母细胞表面的显示水平可以通过一个共价标志物来监测，保证了试验的可重复性，同时有效的提高酵母菌展示纳米抗体的结果。