本发明公开了一株分泌托拉塞米单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。本发明合成了托拉塞米半抗原，制备托拉塞米完全抗原，并将它与等量弗氏佐剂混合乳化完全，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠，首次免疫用弗氏完全佐剂，多次加强免疫用弗氏不完全佐剂，最后一次用托拉塞米完全抗原冲刺免疫。取高效价、低IC50小鼠脾细胞，通过PEG方法与骨髓瘤细胞融合，经过间接竞争酶联免疫法的筛选和三次亚克隆，得到杂交瘤细胞株。此细胞株分泌的单克隆抗体，对托拉塞米具有较好的特异性和检测灵敏度(IC50为0.8ng/mL)。本发明成果可用于建立托拉塞米含量的免疫检测方法，具有实际应用价值。