本发明属于基因编辑技术领域，具体涉及抗非洲猪瘟病毒转基因的重组载体和猪成纤维细胞系及其构建方法和应用。本发明将pCAG‑pH11和px330载体用NOTI和SnaBI双酶切，将两个双酶切后的片段进行连接，得到pCAG‑中间载体；将pCAG‑中间载体利用ASCI和SnaBI双酶切，将含有ASFV CP204L、pS273R、B646L和I215L 4个gRNA的基因合成载体与双酶切后的pCAG‑中间载体连接，得到载体pX330‑pH11‑gRNA‑anti‑AFSV，将其转染猪原代成纤维细胞中，得到成功构建的抗ASFV转基因猪成纤维细胞系，其对于ASFV的研究及药物研发具有重要意义。