本发明涉及采样装置领域，特别是一种细胞培养无菌采样装置及采样方法，包括固定在托板上的后侧板和前侧板，后侧板和前侧板并排平行设置，且与托板垂直，后侧板和前侧板上转动有外圆壳，外圆壳上设有圆孔座，圆孔座的中心处设有圆孔，托板的四角处均固定有支腿；该方法包括：步骤一、托板、后侧板、前侧板和外圆壳组成培养空间，培养皿放置在托板上；步骤二、在采样时，转动外圆壳使圆孔座转动至上方；步骤三、将采样管插入四个消毒棉Ⅰ之间，继而贯穿圆孔进入培养皿内进行采样；步骤四、采样后四个消毒棉Ⅰ自动弹性形变对圆孔进行封堵，回转外圆壳使圆孔座转动至下方，再次对培养空间形成封堵；本发明能够进行无菌采样，避免细菌混入细胞中。