本发明涉及一种飞行时间质谱仪光路校准装置及方法、介质，该装置包括：靶板模拟分划板装置、激光光路调整装置、靶板成像装置、离子光路光轴指示装置，激光光路调整装置、靶板成像装置安装在飞行时间质谱仪上，离子光路光轴指示装置安装在离子透镜上，靶板模拟分划板装置安装在飞行时间质谱仪的运动平台上。本发明解决了飞行时间质谱仪器研发、生产过程中，离子光路、激光光路、成像光路装配过程中存在无校准或者无法定量评估校准的问题，及造成人为因素干扰影响仪器性能和状态的问题，可作为仪器研制、生产过程中的必要质量控制。