本发明提供了一种尼罗罗非鱼星形胶质细胞系及其构建方法和应用，涉及生物细胞模型技术领域。本发明针对尼罗罗非鱼脑组织，采用胰酶消化法分离脑组织细胞，再利用差速贴壁法能进一步减少成纤维细胞的干扰，能更大程度保留脑组织中的胶质细胞进行原代培养，荧光免疫组化检测GFAP信号呈阳性，成功构建罗非鱼脑星形胶质细胞系，可连续传至100代以上，还能维持良好的生长状态，可冷冻保存。本发明所述尼罗罗非鱼脑星形胶质细胞系可以直接用于罗非鱼湖病毒(TiLV)的病原特征分析及疫苗开发研究，还可运用于罗非鱼无乳链球菌脑膜炎机制及鱼源链球菌病的渔药开发研究。