本发明公开了一种高效提取蚯蚓肠道内容物及其胞外DNA的方法，步骤如下：蚯蚓肠道内容物的快速获取；胞外基因组内标基因的构建与制备；蚯蚓肠道内容物胞外DNA的提取。本发明方法一方面可以将个体细小的赤子爱胜蚓的肠道内容物快速取出，步骤简单、耗时短；另一个方面还可以将肠道内容物中的胞外eDNA进行有效分离与提纯，提取效果稳定可靠、重复性好，提取效率可达到61%。通过核酸蛋白测定仪检测，提取的eDNA的OD260/OD280可以达到1.63，OD260/OD230达到1.72，可以进行后续的分子操作。本发明提取方法大大提高了蚯蚓肠道内容物的提取质量，为后续蚯蚓肠道胞外遗传物质的研究奠定了基础。