本发明涉及一种用于筛查肝癌的引物和探针、试剂盒及其应用，包括用于检测CELF6基因甲基化的第一扩增引物对和对应的第一检测探针、用于检测SLMO1基因甲基化的第二扩增引物对和对应的第二检测探针以及用于检测SPINT2基因甲基化的第三扩增引物对和对应的第三检测探针。本发明通过搜集分析TCGA和GEO数据库中肝癌相关的甲基化数据，经过大量研究筛选出与肝癌极具相关性的甲基化基因，通过构建基因甲基化检测体系，并进一步设计优化得到检测效果优异的引物和探针，从而实现了对肝癌进行高灵敏度、高特异性的筛查诊断。