本申请提供了一种定位结构及装配方法、刀具及内窥镜系统，涉及医疗器械技术领域。该定位结构应用于包括刀杆和运动构件的刀具，该定位结构包括限位部件，限位部件用于限制运动构件的运动；与限位部件可拆卸连接的辅助限位部件，辅助限位部件用于与限位部件配合，其中，辅助限位部件包括适于运动构件带动刀杆沿刀杆的轴线方向移动的第一贯通孔。该定位结构能够有效缩短刀具的刀杆长度。尤其对于具有注射功能的高频刀具，通过改变刀杆长度能够有效减少注射过程中的压力损耗，从而进一步优化高频刀具在手术过程中的对黏膜组织的刺穿效果。